2017年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予杰弗理·霍爾（Jeffrey C Hall）、邁克爾·羅斯巴希（Michael Rosbash）、邁克爾·楊（Michael W Young）。三位科學(xué)家的獲獎理由是：因發(fā)現(xiàn)控制晝夜節(jié)律的分子機(jī)制。

　　獲獎人簡介：

　　杰弗里.霍爾(Jeffrey C. Hall)

　　杰弗里.霍爾(Jeffrey C. Hall)，美國遺傳學(xué)家，1945年出生于美國紐約。1971年在西雅圖華盛頓大學(xué)獲得博士學(xué)位，1971年至1973年在加州理工學(xué)院擔(dān)任博士后研究員。1974年，他加入了布蘭迪斯大學(xué)任教職。杰弗里.霍爾現(xiàn)已退休。

　　邁克爾·羅斯巴什（Michael Rosbash）

　　邁克爾·羅斯巴什（Michael Rosbash），美國遺傳學(xué)家，1944年出生于美國堪薩斯城。他于1970年獲得美國劍橋的麻省理工大學(xué)博士學(xué)位。后在蘇格蘭的愛丁堡大學(xué)做了三年博士后研究。1974年以來，在美國沃爾瑟姆的布蘭迪斯大學(xué)任職。

　　邁克爾. 楊（Michael W. Young）

　　邁克爾. 楊（Michael W. Young），美國遺傳學(xué)家，1949年出生于美國的邁阿密。1975年，他在奧斯丁的德克薩斯大學(xué)（University of Texas）獲得了博士學(xué)位。在1975至1977年間，他在Palo Alto的斯坦福大學(xué)擔(dān)任博士后研究員。1978年后，他在紐約的洛克菲勒大學(xué)（Rockefeller University）任職。

　　勇氣和運(yùn)氣：生物鐘的分子研究

　　運(yùn)氣，外在而縹緲；勇氣，內(nèi)生而實(shí)在。運(yùn)氣不會尋找勇氣；勇氣可能碰到運(yùn)氣。

　　在研究生物鐘基因的過程中，事先難以預(yù)料能否取得突破，事后分析發(fā)現(xiàn)勇氣足以成功，而運(yùn)氣是錦上添花，雖然花開的特別燦爛。

　　生物鐘是生物體內(nèi)周而復(fù)始的節(jié)律，如人們熟知的：動物的晝行夜伏、植物的春華秋實(shí)…。常見的近24小時晝夜節(jié)律（circadian rhythm）是典型的生物鐘之一。

　　生物鐘現(xiàn)象看似簡單，其實(shí)不盡然。人們熟知的向日葵朝向太陽，并非每天太陽先出來、向日葵后轉(zhuǎn)向，而是向日葵先朝向、而后才有太陽姍姍來遲。

　　生物鐘的本質(zhì)難以入手，研究不容易。人們用電生理方法研究而不得入門，1971年從果蠅的一個基因出發(fā)開啟了生物鐘的基因研究，23年后才發(fā)現(xiàn)哺乳動物第一個生物鐘基因的突變，26年后明確哺乳類的生物鐘基因與果蠅的類似，30年后才發(fā)現(xiàn)同果蠅一樣的基因也控制人類生物鐘。

　　驅(qū)動生物鐘的內(nèi)在機(jī)理隨著一個一個基因的發(fā)現(xiàn)和研究，逐漸明朗，從果蠅到人存在同樣一批控制生物鐘的基因，它們編碼的蛋白質(zhì)合作共事，節(jié)律性地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄，都采用了負(fù)反饋模式，并與光和溫度等外界因素協(xié)調(diào)，從而對應(yīng)于地球自轉(zhuǎn)的近24小時節(jié)律。

　　研究生物鐘最重要的六位科學(xué)家都在美國，其中五位研究果蠅，一位研究小鼠。加州理工學(xué)院的Seymour Benzer（1921-2007）和Ronald Konopka（1947-2015）開創(chuàng)生物鐘的基因研究，發(fā)現(xiàn)第一個生物鐘基因period（per）。兩個團(tuán)隊(duì)克隆per基因：洛克菲勒大學(xué)的Michael Young（1949-）領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室，Brandeis大學(xué)的Michael Rosbash（1944-）和Jeffrey Hall（1945-）兩個實(shí)驗(yàn)室合作的團(tuán)隊(duì)，他們都還發(fā)現(xiàn)調(diào)控生物鐘的更多基因。哺乳類生物鐘基因研究的突破來自當(dāng)時在美國西北大學(xué)、現(xiàn)在西南醫(yī)學(xué)中心的Joseph S Takahashi（高橋,1951-）。

　　一百多年來，科學(xué)家們因研究果蠅而獲1933、1947、1995和2011年四次諾貝爾獎。如無意外，生物鐘的研究將讓果蠅再度引人矚目。

　　生物鐘的研究歷程，出現(xiàn)過有趣和尷尬的故事？

　　生物鐘的研究是否終結(jié)，沒有重大問題、只剩細(xì)節(jié)了？

　　生物鐘研究逾四十年，為何迄今尚未出現(xiàn)有效的應(yīng)用成果？

　　行為研究的范式變化

　　生物鐘可以看成一種行為模式。

　　行為是可以被其他動物和人類研究者所觀察到的動物外在動作表現(xiàn)。行為研究的范式在1960年以前比較簡單，以描述性為主。

　　因研究消化系統(tǒng)而獲1904年諾獎的俄國科學(xué)家巴甫洛夫（Ivan Pavlov, 1849-1936），后來卻以條件反射的研究更為一般人所熟知。狗見到喜愛的食物會分泌唾液，而原本鈴聲不會誘導(dǎo)狗分泌唾液，但在鈴聲與食物多次同時出現(xiàn)后，單獨(dú)出現(xiàn)鈴聲可以誘導(dǎo)狗分泌唾液，說明聲音刺激與食物刺激之間可以建立聯(lián)系。巴甫洛夫稱食物為無條件刺激，鈴聲為條件刺激，對條件刺激的反應(yīng)為條件反射。這種簡單的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)是20世紀(jì)初行為學(xué)的重要進(jìn)展。

　　行為學(xué)既與生理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)，也與心理學(xué)很近。美國的行為主義開創(chuàng)者John B. Watson（1878-1958）于1913發(fā)表《行為學(xué)主義者宣言》，提出人和動物的行為都很簡單，由后天經(jīng)歷所塑造。1920年他用11個月的男孩Albert做實(shí)驗(yàn)，試圖說明只要后天刺激建立他的恐懼行為，把他本不怕的鼠與鐵棒聲音偶聯(lián)后，他見鼠和兔狗等其他動物都哭，認(rèn)為這是條件反射塑造其行為。

　　美國著名心理學(xué)家B. F. Skinner（1904-1990）推廣行為主義，提出所有動物和人一樣，其行為都由后天刺激所塑造，是極端行為主義的代表。他發(fā)明了具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計：操作性條件反射。巴甫洛夫的條件反射只看動物的反應(yīng)、不看其動作。Skinner用鴿子做實(shí)驗(yàn)，在鴿籠裝兩個鈕，鴿子碰一個鈕會得到吃的獎賞，觸另一鈕無獎。一段時間后，鴿子會經(jīng)常去碰有獎鈕，這種條件反射可以由它主動的行為表現(xiàn)出來，而不是流唾液這種被動反應(yīng)，稱為操作性條件反射，它迄今仍為研究學(xué)習(xí)記憶的重要模型。

　　1973年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予研究行為的科學(xué)家：奧地利的Konrad Lorenz （1903-1989）和Karl von Frisch（1886-1982）、荷蘭的Nikolass Tinbergen（1907-1988）。他們的研究既不是生理學(xué)、更不是醫(yī)學(xué)，而是通過觀察動物行為作出推論，接近十九世紀(jì)的博物學(xué)。

　　von Frisch研究蜜蜂的行為，有多個發(fā)現(xiàn)如蜜蜂有內(nèi)在的生物鐘、有超乎人類的識別偏振光的能力。他得獎是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)蜜蜂通過舞蹈傳送信息：一只蜜蜂發(fā)現(xiàn)食物后，飛回蜂巢告訴其他蜜蜂食物所在地的遠(yuǎn)近和角度、食物的多少。這是一個奇妙的社會行為，刺激科學(xué)界討論動物是否合作、能否交流、以及語言是什么等問題。

　　Tinbergen的哥哥是1969年諾貝爾經(jīng)濟(jì)獎得主。Tinbergen研究動物的本能行為。本能的行為是天生（并不一定是幼年表現(xiàn)的）、到一定時候動物會表現(xiàn)的行為，比如生殖行為無需教導(dǎo)、也無需觀察。Tinbergen和Lorenz發(fā)現(xiàn)動物有刻板動作，如一對鵝在交配后，公鵝要做一套特定動作；而一些刺激可以誘導(dǎo)特定動作，如有些特征可刺激魚視之為敵而攻擊。Lorenz也做過本能實(shí)驗(yàn)，但他更著名的研究是行為的印跡（imprinting）。他用灰腿鵝做實(shí)驗(yàn)，在剛從蛋孵化后一段時期內(nèi)，如果小鵝見到的移動物體只是Lorenz本人，那么以后這些鵝視Lorenz為母親，他走到哪里，它們跟到哪里，甚至長大后碰見真鵝，它們猶豫再三還是跟著Lorenz本人。印跡只能在特定時期產(chǎn)生，稱為臨界期。

　　1951年Tinbergen提出研究行為有四個方面，兩個近端原因（proximate causes）：發(fā)育（行為如何在個體發(fā)育過程中形成），機(jī)理（個體行為的原理）。兩個終極原因（ultimate causes）：進(jìn)化，和功能（如打架為了搶配偶或食物）。

　　行為的研究現(xiàn)在都還有很多停留在描述的程度。如2009年von Bayern等的論文，描述烏鴉如何被迫用小石頭幫助自己獲得嘴巴夠不著的食物。主要的行為學(xué)的教科書《動物行為學(xué)》超過這篇文章的內(nèi)容也不多?！?/span>

　生物鐘研究的突破緣于遺傳學(xué)的應(yīng)用。遺傳學(xué)從孟德爾經(jīng)摩爾根到1960年代初主要研究的核心是遺傳的原理，揭示個體和群體的遺傳規(guī)律。而1960年代末開始，遺傳學(xué)作為重要的工具，提供研究生物現(xiàn)象的途徑。通過突變觀察到基因異常導(dǎo)致的表型，推論基因正常的功能，了解生物學(xué)機(jī)理。美國生物學(xué)家Leland Hartwell（1939-）研究酵母細(xì)胞分裂的遺傳突變，推論參與細(xì)胞分裂的基因，最后有助于理解人類的癌癥。

　　通過異?，F(xiàn)象了解正常規(guī)律，通過個別例外發(fā)現(xiàn)普適原理，是遺傳學(xué)的核心之一。

　　生物鐘的存在和意義

　　生物節(jié)律與其他節(jié)律一樣，有震蕩的幅度、周期、相位。

　　節(jié)律是生物鐘的外在表現(xiàn)，生物鐘是內(nèi)在的定時機(jī)理。生物鐘本身是自我維持的生理和行為節(jié)律發(fā)生器（pacemaker），可以受外界環(huán)境因素（zeitgebers）所導(dǎo)引、從而同步化。

　　生物有多種節(jié)律，不同的生物有著不同的節(jié)律，同一生物也有多種節(jié)律。有些動物每年一個周期的冬眠、有些植物每年一個周期的長葉落葉，動物還有更快的周期如呼吸和心跳…，而人們熟知的節(jié)律是晝夜節(jié)律。不僅大家熟悉的睡眠有晝夜節(jié)律，很多其他行為和生理指標(biāo)也有晝夜節(jié)律。

　　公元4世紀(jì)，Androsthnenes知道羅望子樹樹葉的運(yùn)動有晝夜差別（McClung, 2006）。意大利的Santorio Santorio（1561-1636）前后30年記錄自己從早到晚的攝食量、排泄量和體重變化，發(fā)現(xiàn)有晝夜規(guī)律。但他們未能區(qū)分外界影響的節(jié)律與生物自主的節(jié)律。1729年，法國天文學(xué)家Jacques Ortous de Mairan（1678-1771）用含羞草做材料，觀察其葉片和花的變化，將它放置在全暗處一段時間，葉片仍然有張有合，不依賴陽光，但他當(dāng)時沒敢提出植物的晝夜節(jié)律是內(nèi)在的（de Mairan， 1729；Szymanski，1918）。達(dá)爾文也研究過植物的節(jié)律，并提出晝夜節(jié)律的可遺傳性（Darwin and Darwin，1880）。常見的向日葵好像圍繞陽光的方向轉(zhuǎn)向，但通過紅外照相機(jī)可以看到向日葵朝向東方的行為早于日出，所以也是內(nèi)在節(jié)律所驅(qū)動。晝夜節(jié)律并不依賴于地球自轉(zhuǎn)：放到太空，節(jié)律照常（Sulzman et al., 1984）。

　　Aschoff 和Wever （1976）總結(jié)人的晝夜節(jié)律，德國大學(xué)生待在二戰(zhàn)留下的堡壘中，燈光恒定、食物恒定、溫度恒定、聲音控制。在外界環(huán)境線索缺乏的情況下，人們?nèi)匀槐３謺円构?jié)律，只是在十幾天后相位滯后。

　　現(xiàn)在知道，從簡單的單細(xì)胞藍(lán)綠藻（cynobacteria）細(xì)菌到多細(xì)胞的人，很多生物有生物鐘的存在，但并不清楚是否所有地球上的生物都有晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律周期接近24小時（常見22至25小時）。在環(huán)境線索缺乏時可以繼續(xù)維持，節(jié)律的相位由最后一次環(huán)境線索（如光、或溫度等）所確定。在環(huán)境噪音中，節(jié)律照常運(yùn)行。在一定范圍內(nèi)，節(jié)律周期并不隨溫度的改變而劇烈改變，有溫度補(bǔ)償機(jī)制，這不同于一般生化反應(yīng)：如溫度每上升10℃，酶的催化活性提高一倍。

　　晝夜節(jié)律的生物學(xué)意義目前仍不清楚。當(dāng)然在進(jìn)化過程中，生物活動與地球自轉(zhuǎn)相匹配，也許可以節(jié)省能量、或提高效率。但如果沒節(jié)律又會怎么樣呢？藍(lán)綠藻有晝夜節(jié)律，把正常的藍(lán)綠藻與生物鐘周期異常的細(xì)菌在一起長期培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)最后生物鐘正常的細(xì)菌占了絕大多數(shù)，由此可見生物鐘對生物體有利（Ouyang et al., 1998；Woelfle et al., 2004）。擬南芥的研究也觀察到，周期縮短或延長的擬南芥，其固碳量、生長、存活都是與環(huán)境設(shè)定晝夜周期相吻合的擬南芥最適合，即：短周期突變株在20小時晝夜環(huán)境下生活得更好；而長周期突變株在28小時的模擬環(huán)境下更好（Dodd et al., 2005）。這些觀察，反映了只有當(dāng)內(nèi)外源周期保持一致時才最有利于植物生長。觀察到周期正常有利于植物，不等于能夠解釋為什么，所以我們?nèi)匀皇侵淙?、不知其所以然?/span>

　　生物鐘研究的新途徑

　　怎么研究生物鐘？

　　能看到動物、植物的變化，是外在表現(xiàn)，而不知道生物鐘的核心：振蕩發(fā)生器。

　　可以看到鐘的長針、短針運(yùn)動的軌跡，不等于理解了指揮它們運(yùn)動的機(jī)械裝置。

　　早期科學(xué)家用電生理研究生物鐘，插電極到細(xì)胞觀察電活動，曾觀察到腦內(nèi)特定部位SCN（視交叉上核，suprachiasmatic nucleus）的電活動有晝夜周期。用解剖學(xué)研究，可以了解哪個器官、組織、部位對于個體的生物鐘至關(guān)重要。這一類研究中，在鳥類發(fā)現(xiàn)松果體很重要（Gaston and Menaker，1968；Zimmerman and Menaker，1979），而哺乳類動物的主鐘（master clock）被認(rèn)為是SCN。確定主鐘的實(shí)驗(yàn)有三類，以SCN為例：損毀它導(dǎo)致動物失去晝夜節(jié)律（Moore and Eichler，1972；Stephan and Zucker，1972）；將它加回?fù)p毀后的動物可恢復(fù)晝夜節(jié)律（Lehman et al., 1987）；在搗毀后，移植其他動物的SCN，新節(jié)律與移植物來源的動物節(jié)律一樣，例如，如果移植物來自周期22小時的動物，那么接受移植的動物周期也是22小時，而如果移植物來自周期20小時的動物，接受移植的動物也獲得20小時的周期（Ralph et al., 1990）。

　　如果用遺傳學(xué)研究生物現(xiàn)象，特別是用前饋遺傳學(xué)（forward genetics）——隨機(jī)篩選影響特定生物現(xiàn)象的突變——無需假設(shè)機(jī)理；這有別于通常采用的轉(zhuǎn)特定基因、敲除特定基因的反向遺傳學(xué)（reverse genetics）。這是遺傳篩選的優(yōu)點(diǎn)，但當(dāng)時和現(xiàn)在都有人認(rèn)為遺傳篩選有很大的缺點(diǎn)：很多行為恐怕不是單個或幾個基因所決定的，復(fù)雜的行為需要有很多基因參與，用遺傳篩選對單個和少數(shù)基因有效，對更多基因參與的行為可能效果很差。

　　對于果蠅的行為，Jerry Hirsch就認(rèn)為不能用單基因解釋、也就不能通過遺傳篩選的方法研究行為，只能同時改變很多基因進(jìn)行代間選擇來推斷。而本哲（Seymour Benzer，1921-2007）認(rèn)為果蠅的行為可以用突變單個基因的前饋遺傳學(xué)來進(jìn)行研究。1970年代，他們曾發(fā)生激烈爭論，Hirsch甚至給本哲所在加州理工學(xué)院的每一個教授寫信稱本哲的研究是偽科學(xué)。

　　本哲

　　紐約出生的波蘭猶太裔美國科學(xué)家本哲的大學(xué)是物理專業(yè)，1945年至1953年任教于普渡大學(xué)物理系，先研究過當(dāng)時的熱門：鍺（Benzer, 1946）。1948年他開始通過參加暑期課程、訪問實(shí)驗(yàn)室來學(xué)生物。1953年轉(zhuǎn)到生物系任教，研究分子生物學(xué)，有兩個很重要的工作：遺傳突變就是DNA堿基序列的變化（Benzer, 1955）；基因的順反子定義（Benzer, 1959）。

　　在分子生物學(xué)做出諾貝爾程度的工作后，本哲與英國科學(xué)家、DNA雙螺旋共同發(fā)現(xiàn)者Francis Crick（1916-2004），南非猶太科學(xué)家、mRNA發(fā)現(xiàn)者Sydney Brenner（1927-）等認(rèn)為，分子生物學(xué)的重要問題已解決、框架已建立，以后只有細(xì)節(jié)給后輩填空，而他們應(yīng)該找下一個重要的領(lǐng)域。他們都選了神經(jīng)生物學(xué)：Crick決定研究意識；Brenner決定需要新的模式生物研究神經(jīng)生物學(xué)，他挑選了秀麗線蟲，開發(fā)了線蟲的遺傳學(xué)，帶出一批學(xué)生用線蟲研究了發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué),雖然失去了mRNA應(yīng)該獲得的諾獎，但于2002年因?yàn)檠芯烤€蟲獲獎；本哲學(xué)習(xí)神經(jīng)生物學(xué)后，決定用果蠅研究神經(jīng)生物學(xué)。1967年，本哲轉(zhuǎn)到加州理工學(xué)院，并開始發(fā)表果蠅行為的遺傳學(xué)研究論文（Benzer，1967）。

　　本哲自1967年至2007年一直研究果蠅的行為。他轉(zhuǎn)而研究神經(jīng)生物學(xué)的初期，不僅同事笑他（研究腦袋愚蠢的果蠅，是不是研究者腦袋有毛?。摇奥斆鳌钡膶W(xué)生一般不樂意跟他（你已經(jīng)功成名就，不怕掉進(jìn)陷阱，我們可年輕賠不起，不能舍命陪君子）。這一幕在他和Brenner身上都發(fā)生過。早期他們的學(xué)生要么不求功利、要么不懂生物、要么……總之大多都不是想安安穩(wěn)穩(wěn)的人。

　　結(jié)果，四十年中，本哲和他的學(xué)生們研究的很多方面都領(lǐng)先世界，包括學(xué)習(xí)記憶、性行為、離子通道、眼發(fā)育、人類神經(jīng)退行性疾病的果蠅模型、痛等。他帶出的幾批學(xué)生和博士后成全世界神經(jīng)生物學(xué)的重要一支。

　　本哲的分子生物學(xué)研究達(dá)到了諾獎程度，而他研究生物鐘也明顯達(dá)到諾獎程度。

　　偷懶是創(chuàng)新之母　

　1971年和1972年出現(xiàn)三篇文章，用遺傳學(xué)研究生物鐘。Konopka和Benzer（1971）發(fā)現(xiàn)影響果蠅生物鐘的突變、Feldman和Wasar（1971）發(fā)現(xiàn)影響真菌（粗糙面包霉）生物鐘的突變、Bruce（1972）發(fā)現(xiàn)影響綠藻生物鐘的突變。突變是DNA序列的變化，位于特定基因內(nèi)部、或者旁邊的DNA變化，可能影響基因的功能。有突變就有基因，這是那以前的遺傳學(xué)常識。

　　早在1935年就知道果蠅有生物節(jié)律。因?yàn)楣壍难芯空叨?，其研究工具多于真菌和綠藻。當(dāng)然研究果蠅生物鐘的科學(xué)家前赴后繼也很重要。最終，果蠅的研究對生物鐘的理解起到的推動作用不僅多于真菌和綠藻，也多于其他任何生物。

　　生物鐘的課題為當(dāng)時還是研究生的Ronald Konopka（1947-2015）所提出（Rosbash，2015），在本哲用遺傳研究行為的總體框架之中。　

　　遺傳篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計是：建立檢測表型的方法，用致變劑誘導(dǎo)特定生物的不同基因發(fā)生突變，檢測不同突變種的表型。具體到果蠅的生物鐘，就應(yīng)該是建立檢測生物鐘的方法，用化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)不同基因突變，然后一只一只檢測果蠅，以便發(fā)現(xiàn)改變了晝夜節(jié)律的突變種。

　　當(dāng)時沒人知道果蠅有約兩萬個基因，化學(xué)分子誘發(fā)隨機(jī)突變，只做兩萬只果蠅不夠，其中部分突變在相同基因，所以應(yīng)該加幾倍，才可能大部分基因都突變過一次。因行為有漂移，一個基因的突變種，不能僅檢測一只果蠅，應(yīng)該檢測幾只到幾十只。果蠅是二倍體，每個基因有兩套，一套壞了可以被另一個等位基因所代償，所以最好不要做子一代（F1）的篩選，而最好是F2代，傳代后再篩選，而F2代只有四分之一是同一基因突變的純合子那么需要篩選的數(shù)量應(yīng)一兩百萬，才算做過全基因組的篩選。

　　檢測果蠅晝夜節(jié)律的標(biāo)準(zhǔn)方法，是將單只果蠅放到透明的管中，管子只容一只果蠅來回走動。一束光射過小管的中央，凡是果蠅走過管中央，計算機(jī)就記錄果蠅運(yùn)動了一次。以此檢測果蠅活動的變化，發(fā)現(xiàn)確實(shí)有晝夜規(guī)律。如檢測很多果蠅，工作量比較大。

　　Konopka和Benzer用了兩個偷工減料方法來加快速度。其一是果蠅遺傳學(xué)特有的attached X，可以快速檢測X染色體的突變。其二是他們決定不篩選晝夜節(jié)律，而篩另一節(jié)律：果蠅羽化。果蠅受精卵成為胚胎，發(fā)育成為幼蟲，三次蛻皮后成為蛹，蛹經(jīng)過羽化成為成蟲。

　　晝夜活動節(jié)律是果蠅成蟲每天經(jīng)歷一次、幾十天周而復(fù)始的循環(huán)。而果蠅一生僅羽化一次。羽化一般在黎明前，最遲也在上午。三十年代到五十年代的研究明確提出羽化為獨(dú)立于溫度的生物鐘所控制（Kalmus，1935，1940a，1940b，Pittendrigh，1954）。但是，一生一次的羽化的生物鐘與成蟲每天的活動生物鐘，是否有關(guān)，當(dāng)時并不清楚。

　　Konopka覺得羽化作為篩選方法很容易操作。用單只果蠅做經(jīng)典的晝夜活動規(guī)律檢測比較慢。如果用羽化作為篩選方法，就很便當(dāng)：化學(xué)誘變處理得到各種突變的果蠅猴，Konopka每天上午不來上班，午后到實(shí)驗(yàn)室把所有羽化的果蠅倒掉，留下其他蛹，下午到晚上再羽化的就是影響節(jié)律的突變種，因?yàn)樗鼈兊挠鸹瘯r間不同于正常（所謂“野生型”）果蠅。這樣的方法大大簡化了檢測、加速了篩選。

　　偷懶，依賴人腦的偷懶，（有時）是創(chuàng)新之母。

　　生物鐘研究的突破

　　對于一個研究生來說，用如此簡單的方法，不難篩選幾萬只、幾十萬只、幾百萬只果蠅。但Konopka只篩選了不到兩百種品系的果蠅就得到第一個突變品系，繼續(xù)篩選不到兩千種品系的果蠅再得到兩個突變品系?！?/span>

　　他們用羽化篩到突變品系后，更重要的是用標(biāo)準(zhǔn)檢測運(yùn)動的晝夜節(jié)律之方法看個體的晝夜活動是否變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)確實(shí)突變果蠅的運(yùn)動晝夜節(jié)律異常。有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)的三種品系的突變果蠅在表型上并不相同：一種沒有節(jié)律，一種節(jié)律周期長短加快到19小時，一種節(jié)律變慢到28小時。他們進(jìn)一步將突變種與已有的其他突變交配，確立三種突變在染色體圖譜的大概位置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)很近，他們進(jìn)一步把三種突變相互交配，進(jìn)行本哲發(fā)明的順反檢測，試圖確立它們是否同一基因，他們根據(jù)得到的結(jié)果推測三種突變可能是同一個基因的不同突變。他們把這個基因命名為period（簡寫per），無節(jié)律的為per0（per zero）、節(jié)律短的為pers（per short）、節(jié)律長的為perl（per long）。這里需要說明，他們進(jìn)行的順反檢測并不嚴(yán)格，只做了反位（trans）的檢測沒做順位（cis）的檢測，所以只從1971年的文章不能完全斷定三個突變是否同一基因，雖然當(dāng)時的結(jié)果支持這一可能。

　　他們篩選的果蠅數(shù)量不多，卻得到了一個基因的三種不同方向的突變，因此顯得特別有運(yùn)氣。

　　各種篩選和檢測生物鐘的方法，都有可能在一些非生物鐘關(guān)鍵的基因?qū)е碌耐蛔兌兴绊憽Ｍ粋€基因可以出現(xiàn)三個方向的突變，不僅是運(yùn)氣，而且對于這個基因的功能也提供了很好的支持：很難設(shè)想不參與驅(qū)動生物鐘的基因可以導(dǎo)致三個不同方向的突變表型。如果三個突變確為一個基因的三種突變，那么per基因很可能是生物鐘的關(guān)鍵基因之一。

　　本哲于1940年代末期學(xué)生物的老師、1969年諾獎得主、德國物理學(xué)家轉(zhuǎn)為美國生物學(xué)家的Max Delbrück（1906-1981），這時也在加州理工學(xué)院，他聽本哲說結(jié)果后，并不信找到了生物鐘的基因：

　　Max Delbrück: “I don’t believe it”

　　Benzer: “But Max, we found the gene!” 

　　Delbrück: “I don’t believe a word of it.”

　　克隆per基因：競爭的好處

　　1971年，因?yàn)榧夹g(shù)缺乏，不可能得到per基因的DNA（“克隆基因”）。重組DNA技術(shù)于1973年才發(fā)明，而克隆果蠅DNA的技術(shù)還要等到1978年在斯坦福大學(xué)的David Hogness和加州理工學(xué)院的Tom Maniatis等人的工作推動下才能進(jìn)行。待所有技術(shù)都成熟以后才開始研究較容易，也容易成為跟風(fēng)；不待技術(shù)成熟就開始研究是開拓，但有很大的危險，如果領(lǐng)先幾十年，可能開拓者一生也用不上。

　　1980年代是基因克隆的烽火連天時代。兩個團(tuán)隊(duì)競爭克隆果蠅的per基因：洛克菲勒大學(xué)的Michael Young（楊邁克）；Brandeis大學(xué)的Jeffrey Hall（霍爾）與Michael Rosbash（羅斯巴希）。楊邁克是研究果蠅出身，博士后的老師為克隆果蠅DNA的先驅(qū)David Hogness?；魻柺潜菊艿牟┦亢?，懂果蠅，到Brandeis后與分子生物學(xué)專長的同事羅斯巴希合作。這些科學(xué)家都還有其他研究課題，楊邁克同時在與耶魯大學(xué)的希臘裔生物學(xué)家Spiros Artavanis-Tsakonas競爭克隆Notch基因，霍爾還在研究果蠅性行為的fruitless基因，羅斯巴希多年用酵母研究mRNA剪接機(jī)理。

　　1984年，楊邁克和霍爾—羅斯巴希兩個團(tuán)隊(duì)都拿到Per基因附近的基因組DNA（Bargiello and Young，1984；Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984）。這段DNA可以產(chǎn)生4.5kb和0.9kb兩種mRNA，所以可能對應(yīng)兩個基因。霍爾—羅斯巴希組觀察到0.9kb之mRNA的含量有晝夜變化（Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984），認(rèn)為相應(yīng)的DNA為per基因。楊邁克認(rèn)為4.5kb對應(yīng)的基因是Per基因。后來兩個團(tuán)隊(duì)都確認(rèn)4.5kb對應(yīng)的是per基因（Bargiello et al., 1984； Hamblen et al., 1986; Lorenz et al., 1989）。將編碼4.5kb mRNA的基因組DNA轉(zhuǎn)入果蠅，可以使per突變種果蠅的晝夜節(jié)律恢復(fù)正常。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)改變導(dǎo)入的per基因表達(dá)的相位可改變果蠅晝夜節(jié)律的相位（Edery et al., 1994）。

　　在兩個團(tuán)隊(duì)的競爭過程中，一個組出現(xiàn)錯誤（霍爾—羅斯巴希組最初錯認(rèn)了per基因），被另外一個組糾正，這是競爭對科學(xué)界的好處。

　　兩組科學(xué)家都確定了per基因在最初三種突變株的DNA變化：per0、pers、perl分別是提前終止、和兩個不同部位的堿基變化（Baylies et al., 1987; Yu et al., 1987a）。

　　霍爾—羅斯巴希組的中國留學(xué)生俞強(qiáng)還發(fā)現(xiàn)，缺失per蛋白質(zhì)特定一段區(qū)域，晝夜活動節(jié)律不受影響，只影響求偶時果蠅翅膀有節(jié)律的歌唱（Yu et al., 1987b）?；魻枌?shí)驗(yàn)室在1980年發(fā)現(xiàn)果蠅求偶時的翅膀振蕩有節(jié)律（Kyriacou and Hall，1980），其后有爭議，近年有人正式提出商榷（Stern, 2014; Kyriacou et al., 2017; Stern et al., 2017）。

　　霍爾—羅斯巴希組早期參與生物鐘研究的中國留學(xué)生有：復(fù)旦大學(xué)本科畢業(yè)的俞強(qiáng)，北京醫(yī)學(xué)院的劉欣（Liu et al., 1988, 1992），復(fù)旦的黃佐石 （Huang et al., 1993），武漢大學(xué)的曾紅葵（Zeng et al., 1996）。

　　per的功能：競爭的壞處

　　拿到基因，令人鼓舞。

　　但是，拿到基因不一定就能夠立即知道機(jī)理。正如測序人類基因組只是工具，而不是美國總統(tǒng)等政治人物在一些羞恥感比較弱的科技工作者誘導(dǎo)下稱測序人類基因組就是揭示人類奧秘。今天對人類的奧秘還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不清楚，單純測序本身也沒有自動解開人類奧秘。

　　同理，拿到了per基因的DNA，并不知道它所編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的功能，也不能推導(dǎo)出生物鐘的機(jī)理。有時，拿到基因后很長時間都不能理解其功能，也就不能理解生物學(xué)過程或者人類疾病的機(jī)理。比如，萊－尼（Lesch-Nyhan）綜合征，病人自殘，是很特殊的疾病，其基因已經(jīng)知道多年，編碼HGPRT（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶），是核酸代謝的一個酶，但知道基因、知道蛋白質(zhì)都不能告訴我們?yōu)槭裁床∪藭詺垼膊荒芨嬖V我們有殘害他人能力的人們絕大多數(shù)都不會自殘的生理學(xué)原因。

　　要推出基因編碼蛋白質(zhì)的功能，如果其預(yù)計的氨基酸序列與其他某種蛋白質(zhì)有相似性，那么功能就可能相似，從而可以提供研究的著手點(diǎn)。兩個組都看到per蛋白質(zhì)有部分序列是重復(fù)的，楊邁克實(shí)驗(yàn)室還以為它相似于小鼠的序列（Shin et al., 1985），后來發(fā)現(xiàn)并非如此。

　　1986年，兩個課題組都發(fā)表文章稱per蛋白質(zhì)是蛋白多糖（Jackson et al., 1986; Reddy et al., 1986）。這次兩個課題組都錯了，競爭的課題組錯成一樣是咄咄怪事。

　　1987年，楊邁克課題組與愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的David Spray實(shí)驗(yàn)室合作，進(jìn)一步發(fā)表文章（Bargiello et al., 1987），稱Per影響了細(xì)胞間交流（提示per可能起縫隙連接相關(guān)的功能，比如縫隙蛋白），這一結(jié)果很可能是從猜測per是蛋白多糖——可能是膜蛋白——所以可能是縫隙蛋白的潛意識造成。但這一結(jié)果不能重復(fù)，1992年楊邁克和Spray合作團(tuán)隊(duì)不得不道歉并收回1987年令人矚目的《自然》文章（Saez et al., 1992）?；魻枴_斯巴希組于1993年也發(fā)表文章說明Per不參與細(xì)胞間連接（Flint et al., 1993）。

　　從1984至1987，在激烈競爭的過程中，兩個課題組都錯了兩次：各自分別錯了一次，同時錯了一次。同一項(xiàng)研究錯過兩次的比較少，出一樣的錯不免尷尬。

　　per mRNA的研究：仔細(xì)不是壞事 

　　克隆獲得了基因，再看基因的表達(dá)是自然的延伸。

　　分子生物學(xué)的“中心法則”：DNA—RNA—蛋白質(zhì)。DNA承載遺傳信息，可以復(fù)制和遺傳；在DNA指導(dǎo)下，遺傳信息轉(zhuǎn)錄為信使核糖核酸（mRNA）；在mRNA指導(dǎo)下合成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)再起各種功能。不同基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同mRNA、得到不同蛋白質(zhì)，產(chǎn)生不同功能。

　　檢測基因表達(dá)可以檢測mRNA的表達(dá)，也可以檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)。一般來說，一個動物的大部分細(xì)胞含有同樣的DNA，而含有不同的mRNA和蛋白質(zhì)?；魻枴_斯巴希組、楊邁克組都檢測per的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)在什么時間和空間（James et al., 1986；Saez and Young, 1988；Liu et al., 1988；Siwicki et al., 1988；Zerr et al., 1990；Liu et al., 1992），其中費(fèi)了很大的勁制造per蛋白質(zhì)的抗體，因?yàn)閙RNA只能抗基因表達(dá)的區(qū)域和細(xì)胞，幫助理解哪些區(qū)域和細(xì)胞可能是果蠅的生物鐘。但mRNA不能看到其產(chǎn)物蛋白質(zhì)所在的亞細(xì)胞定位，而抗體可以識別蛋白質(zhì)而確定per蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的位置。per蛋白質(zhì)好像既可以存在于細(xì)胞核、也可以存在于細(xì)胞質(zhì)（Saez and Young，1988；Siwicki et al., 1988）。到1992年，劉欣的文章才確認(rèn)per蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞核（Liu et al., 1992）。

　　既然per基因參與晝夜節(jié)律，那么per的基因表達(dá)（mRNA或者蛋白質(zhì)）是否也有時間調(diào)控，例如晝夜差別？ 1988年，霍爾—羅斯巴希組提出per的蛋白質(zhì)有晝夜變化（Siwicki et al., 1988）。per的mRNA是否有晝夜變化？理論上，研究RNA變化比研究蛋白質(zhì)容易，因?yàn)椴灰蕾囉讷@得好的抗體，而只要得到基因的DNA就很快可以通過普通的分子生物學(xué)方法研究mRNA的表達(dá)。但最初未見per的mRNA晝夜變化。一個可能是做實(shí)驗(yàn)的人技術(shù)不好、或不仔細(xì)，一個可能是偶然的：傳說最初檢測per mRNA的人，是從果蠅全身獲得RNA，只分晝夜時間、不分身體部位。而出現(xiàn)突破的1990年，是從果蠅頭部提取RNA，避免其他部分（如腹部）所含RNA掩蓋了頭部mRNA。

　　為什么需要專門研究頭里的per基因?這與晝夜節(jié)律的關(guān)鍵部分存在于身體什么部位有關(guān)。在得到per基因突變后，Handler和Konopka專門在不同突變型的果蠅之間進(jìn)行局部細(xì)胞的移植，以便確定哪個部位起決定性作用。從pers果蠅取得腦組織，移植到per0果蠅腹腔中，發(fā)現(xiàn)per0變成了pers，顯示腦確定節(jié)律（Handler and Konopka，1979）。1983年，離開加州理工學(xué)院在Clarkson大學(xué)的Konopka等再用遺傳嵌合體做實(shí)驗(yàn)，讓果蠅部分區(qū)域的細(xì)胞含突變的per（如pers），而其余部分仍然正常，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：如果腦含pers，果蠅的生物鐘就變短（Konopka et al., 1980）。所以，移植實(shí)驗(yàn)和嵌合體實(shí)驗(yàn)皆支持per基因在腦中控制全身的晝夜節(jié)律。

　　1990年，霍爾—羅斯巴希組的博士后Paul Hardin終于每個小時取果蠅的頭得到mRNA，再檢測per的mRNA，發(fā)現(xiàn)它呈晝夜變化（Hardin，Hall，Rosbash，1990）。在pers中，per的mRNA晝夜周期也縮短。他們提出簡單的模型：per的基因轉(zhuǎn)錄per的mRNA、翻譯產(chǎn)生per蛋白質(zhì)的過程存在負(fù)反饋，per的mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)生后，可以影響per基因自身的轉(zhuǎn)錄。他們當(dāng)時不能排除per調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律這一行為之后，行為再通過更復(fù)雜的反饋?zhàn)饔糜趐er基因轉(zhuǎn)錄。這里需要用Occam剃刀原則，既首先檢測最簡單的可能性。這一簡單解釋提供了生物鐘機(jī)制的理論突破，是迄今為止仍被公認(rèn)的“轉(zhuǎn)錄—翻譯負(fù)反饋環(huán)路（transcription-translation feedback loop, TTFL）”的基礎(chǔ)，羅斯巴希稱贊提出這一模型的博士后Hardin。

　　如果這一假設(shè)正確，那么per蛋白質(zhì)就是基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。而對于轉(zhuǎn)錄因子，1980年代有很多進(jìn)展，從而可以為研究per和生物鐘的機(jī)理提供很好的借鑒。

　　不久，霍爾—羅斯巴希組的Zerr又用抗體檢測提出per蛋白質(zhì)的表達(dá)，在部分腦區(qū)也有晝夜節(jié)律，這種節(jié)律的長短也被per本身所調(diào)節(jié)，因?yàn)樵谏镧娍s短的果蠅突變種pers中，per的蛋白質(zhì)晝夜周期也縮短（Zerr et al., 1990）。mRNA的晝夜節(jié)律與蛋白質(zhì)晝夜節(jié)律之間有一定的間隔，也就是相位不同。幾年之后知道不僅per蛋白質(zhì)含量變化，而且其亞細(xì)胞定位變化：晝夜周期中，per蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的時間有晝夜周期變化（Curtin et al., 1995）。

　　基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控　

　　1990年，研究果蠅生物鐘的Hardin等提出per蛋白質(zhì)可能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，依據(jù)的是間接證據(jù)。　

　　1991年和1992年，其他途徑的研究發(fā)現(xiàn)了幾個與per有相似性區(qū)域的蛋白質(zhì)。研究果蠅胚胎發(fā)育的Crews實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一個基因single minded（sim），其缺失導(dǎo)致果蠅胚胎腹側(cè)中線的神經(jīng)細(xì)胞缺乏（Nambu et al., 1990）。研究環(huán)境致癌物的Hoffman等和Burbach等，發(fā)現(xiàn)一個被致癌物二惡英(dioxin)作用的受體Ah R（Hoffman et al., 1991；Burbach, Poland, Bradfield, 1992）。per、Ah R和sim三個蛋白質(zhì)都相似的區(qū)域稱為PAS區(qū)域。

　　因?yàn)锳hR確定是轉(zhuǎn)錄因子，而且有專門調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的區(qū)域bHLH，所以提示per和SIM也是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，但per缺AhR具有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，只有PAS區(qū)域。1993年，羅斯巴希實(shí)驗(yàn)室的黃佐石證明，PAS區(qū)域是蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域，PAS和PAS可以偶聚化（Huang, Edery and Rosbash，1993）。進(jìn)一步研究提出，具有bHLH和PAS區(qū)域的蛋白質(zhì)可能是轉(zhuǎn)錄激活因子，而只有PAS但缺乏bHLH的per蛋白質(zhì)不能激活轉(zhuǎn)錄但可以抑制能夠激活轉(zhuǎn)錄而同時有bHLH和PAS區(qū)域的蛋白質(zhì)（Lindebro, Poellinger and Whitelaw，1995）。

　　Hardin自己獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室后，證明per蛋白質(zhì)調(diào)控per基因轉(zhuǎn)錄，依賴于per基因在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域之上游（分子生物學(xué)稱為5’端）的DNA序列（Hao, Allen and Hardin, 1997）。以后有更多證據(jù)表明，per參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，而且與多個基因有關(guān)。

　　更多參與果蠅生物鐘的基因

　　影響生物鐘不可能只有一個基因?！?/span>

　　1971年發(fā)現(xiàn)第一個影響果蠅生物鐘的基因per?！?/span>

　　1983年，Jackson發(fā)表了影響果蠅生物鐘的其他基因（Jackson，1983），但無果而終。

　　1990年，霍爾—羅斯巴希組發(fā)表“新”的果蠅晝夜節(jié)律基因“鐘”（Clock）（Dushay et al., 1990），不夠他們于1992年發(fā)現(xiàn)這不是新的基因而僅為per基因的另一突變而已（Dushay et al., 1992），辛勤努力化為一江春水?！?/span>

　　1991年Konopka 等發(fā)表第二個影響果蠅生物鐘的基因Andante （Konopka, Smith and Orr，1991）。注意這一基因的人不多，到2003年它才被Tufts大學(xué)的RobJackson實(shí)驗(yàn)室所克隆（Akten et al., 2003）。

　　1991年洛克菲勒大學(xué)楊邁克實(shí)驗(yàn)室的Sehgal等在會議上報道她們篩選影響果蠅生物鐘的新基因（Sehgal et al., 1991）。

　　1994年，楊邁克實(shí)驗(yàn)室報道他們發(fā)現(xiàn)了timeless基因（“無時間”，簡稱Tim），這次Seghal等通過篩選7千多個突變種找到第三個影響果蠅生物鐘的新基因（Seghal et al., 1994）。他們用了轉(zhuǎn)座子插入誘導(dǎo)突變，以利克隆基因，而最初的檢測也是羽化，其后用活動節(jié)律核實(shí)確實(shí)影響了晝夜節(jié)律。她們還發(fā)現(xiàn)tim的突變也影響per的RNA晝夜變化，所以與per基因相關(guān)。楊邁克實(shí)驗(yàn)室的研究生Leslie Vosshall發(fā)現(xiàn)Tim影響Per蛋白質(zhì)出入細(xì)胞核（Vosshall et al., 1994）。

　　楊邁克實(shí)驗(yàn)室很快克隆到tim基因（Myers et al., 1995）。雖然預(yù)計的tim蛋白質(zhì)序列看不出它是怎么作用的蛋白質(zhì)，但因?yàn)樗梢越Y(jié)合per，那么估計也是轉(zhuǎn)錄因子。羅斯巴希實(shí)驗(yàn)室的研究生曾紅葵發(fā)現(xiàn)tim與per兩個蛋白質(zhì)的相互作用有晝夜節(jié)律，而光可以調(diào)節(jié)tim蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而提供了光對生物鐘的調(diào)節(jié)的分子機(jī)理（Zeng et al., 1996）。

　　調(diào)節(jié)其他生物晝夜節(jié)律的基因　

　　多種生物，從細(xì)菌、植物到包括人在內(nèi)的動物，都有節(jié)律、有晝夜節(jié)律。存在于多種生物的生物鐘，是否用同樣的分子？是否用同樣的機(jī)理？ 

　　粗糙面包霉（neurospora）的生物鐘基因Frequency （frq，“頻率”）于1989年被克隆，當(dāng)時以為它與per有部分序列相似（McClung, Fox, Dunlap，1989），后來發(fā)現(xiàn)不相似。

　　控制有些細(xì)菌生物鐘的基因也紛紛被克?。ㄈ?，Liu et al., 1995）。

　　1995年，調(diào)節(jié)植物（如擬南芥）生物鐘的基因被克?。∕illar et al., 1995）。　

　　很多人關(guān)心的是：哺乳類的生物鐘，用什么基因？

　　千呼萬喚始出來：哺乳動物的生物鐘基因

　　調(diào)節(jié)哺乳動物生物鐘的第一個基因tau的突變種于1988年被偶然發(fā)現(xiàn)（Ralph and Menaker，1988），但基因克隆需要等到2000年（Lowrey et al., 2000），它編碼一個蛋白激酶（CKIε）。

　　在克隆了果蠅per基因的1984年至1997年，有很強(qiáng)烈的希望找到哺乳類生物鐘基因，明顯應(yīng)找類似per的基因，但這一途徑費(fèi)盡九牛二虎之力，并無顯著成果。曾找到了蠶的per基因（Reppert et al., 1994），但它無助于找哺乳類的per。

　　時代呼喚英雄，找到哺乳類生物鐘基因的英雄。

　　在美國芝加哥北郊西北大學(xué)工作的日裔科學(xué)家高橋決定不再依賴容易的方法，而用老鼠做遺傳篩選。

　　果蠅很小、生活周期短，方便且便宜。用要貴很多。如果通過篩選找基因，那么除了如果蠅一樣算數(shù)量，還要考慮經(jīng)費(fèi)。為了在一定范圍省時間和經(jīng)費(fèi)，高橋?qū)嶒?yàn)室不篩選純合體突變種，而篩雜合體。不過篩雜合體雖然省了工作量，但也降低了突變檢出率。即使這樣，也需要超過十萬只的老鼠才能篩一遍。有個笑話：做這種實(shí)驗(yàn)，類似把豪華旅館獻(xiàn)給老鼠。

　　1994年，可能世界上沒一個實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為自己有足夠的經(jīng)費(fèi)。很可能用完了經(jīng)費(fèi)還找不到影響老鼠生物鐘的基因，所以沒人敢做。

　　高橋帶領(lǐng)實(shí)驗(yàn)室是發(fā)憤圖強(qiáng)、還是鋌而走險?

　　他們的勇氣遇到了運(yùn)氣。他們當(dāng)時一共只研究了304只小鼠，第25只就是影響生物鐘的突變體，他們從而發(fā)現(xiàn)了影響老鼠生物鐘的基因，他們命名為“鐘”（Clock）（Vitaterna et al., 1994）。正常老鼠生物鐘的周期是23.7小時，Clock雜合的突變鼠晝夜節(jié)律為24.8，變化可謂微妙，需要可靠的檢測才能發(fā)現(xiàn)。從雜合體檢測出微小但可靠的變化后，高橋?qū)嶒?yàn)室很容易通過交配小鼠而獲得Clock基因突變的純合體，其表型很強(qiáng)：完全喪失節(jié)律。

　　1997年，高橋?qū)嶒?yàn)室在《細(xì)胞》雜志發(fā)表兩篇論文，報道他們克隆的老鼠Clock基因（King et al., 1997；Antoch et el., 1997）。

　　老鼠Clock蛋白質(zhì)不僅有與蛋白質(zhì)相互作用的PAS區(qū)域，而且有直接結(jié)合DNA的bHLH區(qū)域（King et al., 1997），從而更容易理解它如何調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。Clock基因本身也表達(dá)于SCN。他們還發(fā)現(xiàn)人、雞、蜥蜴、蛙、魚也有Clock基因（King et al., 1997）。

　　果蠅與哺乳類是否有類似的分子機(jī)理?

　　如果果蠅的per基因只是在果蠅和昆蟲起作用，那么意義就有限。如果找到高等動物的Per并因此開啟研究高等動物生物鐘的分子機(jī)理，那么意義就較大。

　　果蠅的per基因在1984年被克隆后，長期有人（如麻省大學(xué)伍斯特校區(qū)的Steven Reppert）試圖在高等動物中找到Per基因，但無果。一般來說，一個基因在低等動物中發(fā)現(xiàn)后，在高等動物中比較容易找到，有多種方法可以通過DNA序列相似性找到。找不到有幾種可能：Per在高等動物不存在，例如果蠅的生物鐘可能高等動物的生物鐘不同，也可以是果蠅和高等動物生物鐘大體類似但其中有分子不同（如果蠅用per但高等動物不用）；另一可能是研究者技術(shù)上的問題，在高等動物存在Per基因，但未被找到。從1984年到1997年的努力都找不到哺乳動物的per基因的情況下，很多人灰心地認(rèn)為恐怕哺乳類無Per。

　　1997年，兩個實(shí)驗(yàn)室歪打正著，找到老鼠和人的Per （Tei et al., 1997；Sun et al., 1997）。美國華人科學(xué)家在研究其他問題的時候，發(fā)現(xiàn)一個基因與per有序列相似性（Sun et al., 1997）。比較它們后知道，以前沒找到的原因是哺乳類的Per與果蠅的per基因在整個基因的相似性不很高，而局部很高。以前用整體去找很難找到，而用局部的困難在當(dāng)時并不知道哪段是保守的。

　　哺乳類的Per基因有三個 ：Per1、Per2、Per3（Shearman et al., 1997），Per基因表達(dá)在SCN（Shearman et al., 1997），其表達(dá)隨晝夜節(jié)律變化而變化，這一節(jié)律受Clock基因的調(diào)節(jié)（Jin et al., 1999）。

　　1998年，霍爾—羅斯巴希組通過遺傳篩選，也在果蠅找到Jrk基因，發(fā)現(xiàn)就是果蠅的clock基因（Allada et al., 1998）。有趣的是，Steve Kay實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)clock蛋白可以激活帶有per基因啟動子片段E-box驅(qū)動的熒光素（luciferase）報告基因的表達(dá)，這一激活能被per自身所抑制，從而較好地實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋環(huán)路的閉合（Darlington et al., 1998）。

　　首先在果蠅發(fā)現(xiàn)的per基因終于在哺乳類找到了，而首先在老鼠發(fā)現(xiàn)的基因Clock也在果蠅中發(fā)現(xiàn)了，從昆蟲到哺乳類，生物鐘的基因看來高度保守。這雖然是基因水平，但提示機(jī)理也保守。

　　從研究來說，鉆研果蠅生物鐘的科學(xué)家們就不用再擔(dān)心是自己怪癖，而確實(shí)可能是探討和揭示動物相通的普遍機(jī)理。

　　果蠅遺傳篩選對生物鐘研究的重要性

　　在生物鐘的基因研究過程中，果蠅一馬當(dāng)先，科學(xué)家從中發(fā)現(xiàn)了per（Konopka and Benzer，1971）、andante （Konopka, Smith and Orr，1991）、tim（Sehgal et al., 1991, 1994）。

　　用果蠅研究生物鐘，在速度、價格、工作量上都優(yōu)于哺乳類。用細(xì)菌、真菌、植物研究生物鐘，也可以有這些優(yōu)勢，但它們的生物鐘基因與動物的不同，研究它們不能揭示哺乳類的生物鐘機(jī)理。

　　當(dāng)然，在從各種生物得到答案之前，人們無法預(yù)料生物鐘的機(jī)理保守的范圍。但事后可以總結(jié)果蠅對于生物鐘研究的重要性。

　　并非所有低等生物的研究都適用于高等生物，有些相通、有些不同。例如：細(xì)胞周期的原理從酵母到人都保守，而性別確定的機(jī)理從果蠅到人類并不保守。雖然研究低等生物特有的生物學(xué)原理也有科學(xué)意義，但人偏于關(guān)注對高等生物適用的分子和規(guī)律。

　　在發(fā)現(xiàn)per、andante、tim等基因之后，科學(xué)家們還多次用果蠅繼續(xù)篩選影響生物鐘的基因。

　　霍爾實(shí)驗(yàn)室建立用熒光素接在per基因位點(diǎn)，用酶活性間接報告per的轉(zhuǎn)錄情況（Brandes et al., 1996；Stanewsky et al., 1997； Plautz et al., 1997），篩選了5137株影響熒光素表達(dá)的果蠅突變種，發(fā)現(xiàn)chryptochrome （cry）基因參與果蠅生物鐘（Stanewsky et al., 1998）。用果蠅的遺傳研究發(fā)現(xiàn)cry的作用在于介導(dǎo)外界的光調(diào)節(jié)身體內(nèi)在的生物鐘（Stanewsky et al., 1998）。生物鐘在沒有外界環(huán)境影響的情況下，可以自行運(yùn)轉(zhuǎn)。在外界環(huán)境作用下，生物鐘與外界相配合。雖然其他如聲音、溫度、進(jìn)食也可影響生物鐘，外界的光當(dāng)然是調(diào)節(jié)生物鐘的關(guān)鍵因素之一。cry功能的發(fā)現(xiàn)解決了一個重要的問題。這里也可以看到，遺傳篩選不僅為了找到基因，而且有時可能從基因編碼的蛋白質(zhì)推測出分子機(jī)理，而了解機(jī)理是生物學(xué)基礎(chǔ)研究的核心。cry本身的mRNA表達(dá)也有晝夜節(jié)律，它也調(diào)節(jié)per和tim表達(dá)與光的關(guān)系（Emery et al., 1998；Stanewsky et al., 1998）。 

　　果蠅有4套染色體。羅斯巴?！魻柡献骱Y選第三號染色體，用化學(xué)誘變得到遺傳突變種，篩選了6千多種以后，發(fā)現(xiàn)jrk基因（Allada et al., 1998）。令人欣慰的是，果蠅的jrk原來就是小鼠Clock基因的同源基因。再找到的cycle基因，也有小鼠的類似基因Bmal（Rutila et al., 1998）。再度證實(shí)從昆蟲到哺乳類用同樣的基因調(diào)節(jié)生物鐘。

　　楊邁克實(shí)驗(yàn)室在果蠅的第2和第3號染色體篩選了多于1萬5千種突變，發(fā)現(xiàn)了他們命名為doubletime的（“加時”）基因，而它編碼了酪蛋白激酶ε（CKIε）（Price et al., 1998）。它可以調(diào)節(jié)per蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。高橋?qū)嶒?yàn)室于2000年克隆了金倉鼠的tau基因，發(fā)現(xiàn)原來也是CKIε（Lowrey et al., 2000）。開始研究蛋白激酶導(dǎo)致磷酸化、磷酸化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

　　到2001年，已知多個基因在果蠅和小鼠都調(diào)節(jié)生物鐘：包括果蠅的一個per和小鼠的三個Per基因、果蠅的一個cry和小鼠的兩個Cry基因、果蠅的一個jrk/clock和小鼠的兩個Clock基因（Clock和Npas2）、果蠅的cycle和小鼠的Bmal1基因、果蠅的doubletime和小鼠的CKIδ和CKIε基因（Reppert and Weaver, 2001）。

　　篩選生物鐘相關(guān)基因的其他途徑

　　在完全不理解分子機(jī)理的情況下，用遺傳篩選生物鐘，是很強(qiáng)的方法。從分子上，稱之為“盲篩”，未嘗不可。盲篩的優(yōu)點(diǎn)在于無需事先知道機(jī)理，而通過遺傳得到突變、DNA克隆得到分子、分子的序列特征或更多研究，再揭示機(jī)理，或提供揭示機(jī)理的可能性。這是一些人所謂的“遺傳學(xué)的令人敬畏的力量”（the awesome power of genetics）。這一途徑被用于多個重要問題的研究，生物鐘是早期的研究對象之一，但非唯一。

　　在有其他線索時，在有其他突破點(diǎn)時，自然也無需假定遺傳學(xué)是唯一途徑。

　　在生物鐘研究中，當(dāng)人們知道Per的mRNA表達(dá)有晝夜節(jié)律， Per蛋白質(zhì)與Tim蛋白質(zhì)有相互作用，蛋白激酶參與生物鐘，那么可以通過這些特征找其他基因（Abruzzi et al., 2017）。當(dāng)技術(shù)發(fā)展，如分子生物學(xué)的RNAi（RNA干擾）技術(shù)等之后，也自然可以用新技術(shù)研究老問題。

　　事實(shí)上，早在1995年，哈佛醫(yī)學(xué)院Weitz實(shí)驗(yàn)室的Gekakis等通過Per蛋白質(zhì)尋找與Per直接相互作用的蛋白質(zhì)，找到Tim蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)Tim與Per兩個蛋白質(zhì)直接結(jié)合（Gekakis et al., 1995）。他們用酵母雙雜交得到的這一發(fā)現(xiàn)與同期楊邁克實(shí)驗(yàn)室用果蠅遺傳篩選的途徑異曲同工。而當(dāng)時在美國圣地亞哥加州大學(xué)（UCSD）Steve Kay實(shí)驗(yàn)室做博士后的張二荃首次用RNAi篩選生物鐘的基因，他利用當(dāng)時已知多種細(xì)胞有生物鐘，而在體外培養(yǎng)的人類細(xì)胞用Per基因插入熒光素基因，通過熒光素基因的表達(dá)周期顯示生物鐘，張二荃因此找到影響人類生物鐘的基因（Zhang et al., 2009）。當(dāng)然用活人是很難篩選基因的，但用體外培養(yǎng)的細(xì)胞就容易多了。

　　從1971年的果蠅篩選到2009年人的篩選，研究的時間跨度很大，但基因并沒有找全。果蠅的篩選就沒有篩完，而是每次都有局限，哺乳動物的篩選更沒有完。如果以后有更多、更好的途徑和方法，包括現(xiàn)有和已經(jīng)用過但并未充分使用的方法，再發(fā)現(xiàn)影響生物鐘的基因，不會令人驚訝。

　　分子機(jī)理和細(xì)胞機(jī)理

　　發(fā)現(xiàn)基因固然重要。

　　但生物學(xué)基礎(chǔ)研究的目的是闡明機(jī)理。

　　綜合多年的研究結(jié)果，可以看到，Per調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，是分子機(jī)理的突破。簡而言之，Clock和Cycle蛋白質(zhì)組成復(fù)合體，直接刺激一些下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，這些靶基因進(jìn)一步控制生物鐘。而Per和Tim蛋白復(fù)合體抑制Clock和Cycle的作用。Per基因和Tim基因本身還是Clock和Cycle的靶基因，從而組成轉(zhuǎn)錄反饋環(huán)。Per蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性被磷酸化所調(diào)節(jié)，也就被doubletime或CK1δ和ε等蛋白激酶和去除磷酸化的蛋白磷酸酶所調(diào)節(jié)（Wijnen and Young，2006；Benito et al., 2007）。還有糖化修飾調(diào)節(jié)Per和Clock蛋白質(zhì)。Cry介導(dǎo)光調(diào)節(jié)Tim/Per的穩(wěn)定性。在Clock/Cycle和Per/Tim參與的主要轉(zhuǎn)錄環(huán)之外，還有其他轉(zhuǎn)錄環(huán)。還有其他基因如pdp1、vri、RORa和REV-ERBα參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

　　Per和Tim蛋白質(zhì)不僅有穩(wěn)定性的問題，而且還有亞細(xì)胞定位問題：在細(xì)胞漿、還是細(xì)胞核。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它們只有在進(jìn)入細(xì)胞核才能見到基因調(diào)節(jié)的機(jī)器，才能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄（Siepka et al., 2007；Dubowy and Sehgal，2017）。Per和Tim的mRNA在白天逐漸升高，到傍晚大大最高峰。兩個蛋白質(zhì)的合成晚于其mRNA幾小時后逐漸積累，先在細(xì)胞漿，午夜進(jìn)入細(xì)胞核。Tim蛋白質(zhì)既在細(xì)胞漿內(nèi)穩(wěn)定Per蛋白質(zhì)，也促進(jìn)Per進(jìn)入細(xì)胞核（Meyer, Saez and Young，2006）。

　　有趣的是，雖然細(xì)菌、真菌、和植物分別由其他分子組成生物鐘，核心都是振蕩器。這些生物的振蕩器由不同的分子組分，也是通過正反饋和負(fù)反饋來實(shí)現(xiàn)。外界的光或其它因素通過一定方式影響生物鐘的它們也用了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、和磷酸化調(diào)節(jié)等（綜述見Wijnen and Young，2006）。而植物的生物鐘還用了細(xì)胞漿和細(xì)胞質(zhì)定位的調(diào)節(jié)（Wang and Tobin，1998；Mas，2008）。因此，從細(xì)菌到人不同生物的生物鐘存在原理的共同性。

　　在細(xì)胞層面，目前認(rèn)為，動物體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞（甚至所有細(xì)胞）都有生物鐘（Emery et al., 1997；Giebultowicz and Hege，1997；Plautz et al., 1997）。果蠅的翅膀切下后依然可以觀察到其中的生物鐘影響，人的肝臟細(xì)胞體外培養(yǎng)也表現(xiàn)出代謝上的節(jié)律?，F(xiàn)在認(rèn)為生物鐘分為中樞的主鐘和外周的鐘。

　　在果蠅體內(nèi)，推測大約150個表達(dá)Per和Tim基因的神經(jīng)細(xì)胞組成主鐘（master clock），在哺乳類由SCN組成主鐘。小鼠的SCN含約兩萬個細(xì)胞，人的SCN約五萬細(xì)胞。外周鐘可以自行運(yùn)轉(zhuǎn)，但主鐘控制全身的外周鐘，特別是同步化外周鐘。

　　Konopka和Benzer在1971年的文章就指出，突變基因起作用的解剖部位很重要。也就是說如果能夠找到這些細(xì)胞，就可能找到主生物鐘。一般推測果蠅腦含約25萬個神經(jīng)細(xì)胞，而其中150個細(xì)胞是主生物鐘的推測是依據(jù)Per和Tim的功能和基因表達(dá)部位（Konopka and Benzer,1971；Vosshall and Young, 1995；Kaneko，Helfrich-Forster, Hall，1997；Panda，Hogenesch and Kay，2002；Helfrich-Forster, 2005）。它們包括：背側(cè)的神經(jīng)元DN1、DN2、DN3，側(cè)后神經(jīng)元LPNs，側(cè)面偏背神經(jīng)元LNd、側(cè)面偏腹小神經(jīng)元sLNvs、側(cè)面偏腹大神經(jīng)元lLNvs。其中l(wèi)LNvs神經(jīng)元全部含PDF神經(jīng)肽，而5個sLNvs中4個含PDF（Nitabach and Taghert，2008）。PDF在生物鐘也起重要作用（Renn et al., 1999）。這些細(xì)胞的功能也不一樣，含PDF的sLNvs細(xì)胞為控制果蠅早上活動的早晨細(xì)胞，而LNd和不含PDF的sLNvs細(xì)胞為控制果蠅傍晚活動的傍晚細(xì)胞。

　　哺乳動物的主鐘內(nèi)部也有分工和協(xié)調(diào)。SCN的神經(jīng)細(xì)胞分離的狀態(tài)下，分別有節(jié)律但不同步，而它們在一起時節(jié)律同步，有神經(jīng)肽等分子參與，有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

　　人的生物鐘相關(guān)基因

　　雖然生物鐘對人很重要，而我們較晚理解人的生物鐘理解。遺傳和基因分析起了突破性的作用，并且與果蠅相似。

　　用8753對成年雙胞胎的研究表面，人的晝夜節(jié)律與很強(qiáng)的遺傳性（Koskenvuo et al., 2007）。

　　2001年，舊金山加州大學(xué)（UCSF）的Ptácek和Fu兩個合作實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，人的Per2基因（hPer2）與人的生物鐘相關(guān)。他們研究了一家遺傳性的相位變化。這家人的相位變快（家族性睡眠相位提前綜合征，F(xiàn)ASPS），每天早上4點(diǎn)半醒，晚上7點(diǎn)半要睡，相位比一般人提前4小時。Ptácek和Fu對此家系的遺傳分析發(fā)現(xiàn)，他們中凡有hPer2編碼的特定位點(diǎn)（對應(yīng)于其蛋白質(zhì)序列的662位氨基酸）變化后，就患相位提前的病，凡是這個位點(diǎn)正常的人，就沒有相位提前?。═oh et al., 2001）。662位點(diǎn)相應(yīng)的氨基酸是絲氨酸（簡稱S），他們當(dāng)時以為S662是由CKIδ所磷酸化。2005年在Ptácek和Fu實(shí)驗(yàn)室工作、現(xiàn)任教于蘇州大學(xué)的徐瓔發(fā)現(xiàn)CKIδ基因突變也能在人和小鼠導(dǎo)致相位提前（Xu et al., 2005）。

　　其后有更多基因被發(fā)現(xiàn)參與人的生物鐘（He et al., 2009）。楊邁克實(shí)驗(yàn)室于2017年發(fā)現(xiàn)人的Cry1基因突變可以導(dǎo)致生物鐘相位推遲（晚睡晚起）（Patke et al., 2017）。

　　運(yùn)氣和勇氣：孰輕孰重

　　生物鐘遺傳研究確實(shí)有運(yùn)氣，但也有勇氣。

　　在看不清前途時默默探索，在一個小領(lǐng)域內(nèi)長期耕耘；遇困難出差錯恐在所難免，碰運(yùn)氣獲機(jī)遇也時有所得。

　　粗看似乎運(yùn)氣重要，細(xì)看可見勇氣重要：勇于做前人沒做過、旁人沒想過、偉人不相信的工作。

　　Konopka和Benzer從兩千只果蠅中篩到三只突變果蠅，竟然是同一個基因的三個影響完全不一樣的突變。遺傳學(xué)研究的歷史上可能只有這一次小規(guī)模篩選中出現(xiàn)一個基因的三個功能改變的情況；生物學(xué)歷史上，這可能也是絕無僅有；說不定科學(xué)史上也是鳳毛麟角。如果沒有這樣的突變，可能還有些人會比較猶豫生物鐘能否用遺傳進(jìn)行研究，因?yàn)榭梢栽O(shè)想一些在果蠅生物鐘篩選方法中有表型，但不一定反映生物鐘核心機(jī)構(gòu)的基因。表型能否可靠并直接地幫助遺傳學(xué)家研究核心問題，是一個非常重要的問題。果蠅生物鐘的表型，幾十年后的今天看來非?？煽?，但當(dāng)初并不清楚。正如今天問：從果蠅檢測的睡眠，是否真是睡眠？很多人，包括研究果蠅的科學(xué)家，都不敢清晰地回答這一問題。

　　高橋?qū)嶒?yàn)室在老鼠的篩選過程中，第25只老鼠就是影響生物鐘的突變，也有很大的運(yùn)氣。如果沒有這樣的運(yùn)氣，就要花很多的時間，而且老鼠的研究很費(fèi)錢，沒有足夠的人力物力就做不成。一般人預(yù)計到成本，就不能做這樣的研究。

　　現(xiàn)在我們可以事后諸葛亮，總結(jié)以后多個實(shí)驗(yàn)而意識到：實(shí)際上只要做足夠的篩選，不是篩兩千只果蠅，而是篩兩萬只果蠅，基本一定能找到生物鐘的突變。雖然不會得到一個基因的三種不同方向的突變，但同樣會帶來突破的可能性。多次篩選果蠅生物鐘突變種的多次篩選，只有兩次比較倒霉，一次是重復(fù)發(fā)現(xiàn)以前的基因、一次搞錯了，其他都找到基因，而且是新的基因。

　　高橋?qū)嶒?yàn)室用老鼠篩選生物鐘突變基因，也有運(yùn)氣。但事后看來，如果有決心、經(jīng)費(fèi)夠，篩選超過幾千只就應(yīng)該能得到影響生物鐘的基因。而幾千只老鼠的經(jīng)費(fèi)，并非只有高橋?qū)嶒?yàn)室才有。對這一經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)并非徒勞，原在美國西南醫(yī)學(xué)中心、現(xiàn)在日本筑波國際睡眠醫(yī)學(xué)研究所的Masashi Yanagisawa及其團(tuán)隊(duì)，就用較大經(jīng)費(fèi)專門篩選小鼠睡眠的突變種，找到影響小鼠睡眠的基因（Funato et al., 2016）?！?/span>

　　Konopka在研究過程中遇到了生物學(xué)空前絕后的運(yùn)氣，但個人機(jī)遇卻相當(dāng)不好。他畢業(yè)后到斯坦福大學(xué)做過短暫博士后，1974年回加州理工任助理教授，但評終身教授時未通過，主要原因是文章太少。他到Clarkson大學(xué)任教，因人事變動，再次未獲終身教授，1990年回到加州輔導(dǎo)高中生，2015年心臟病去世（Rosbash，2015）。

　　懸而未決的問題

　　今天，生物鐘的重要問題并未全部解決。

　　已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的參與生物鐘的基因，其機(jī)理并非完全清晰。例如，研究的最多、時間最長的是Per，但迄今并不十分清楚Per蛋白質(zhì)如何調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。再如，Ptácek和Fu實(shí)驗(yàn)室從2001到2005的研究表明hPer2在S662位點(diǎn)磷酸化很重要，并提出CKIδ是磷酸這一位點(diǎn)的蛋白激酶。但令人驚訝的是，徐瓔在他們實(shí)驗(yàn)室于2007年發(fā)表進(jìn)一步工作表明CKIδ蛋白激酶并不能磷酸化hPer2蛋白質(zhì)的S662（Xu et al., 2007）。因此，自從2001年發(fā)現(xiàn)的對人的生物鐘至關(guān)重要的S662位點(diǎn)，居然迄今不知道其蛋白激酶。17年來，不同實(shí)驗(yàn)室努力試過找識別磷酸化S662位點(diǎn)的抗體，以便簡單、快速檢測S662是否磷酸化，迄今無成功的報道。Per蛋白質(zhì)有多個可以被磷酸化位點(diǎn)，它們確實(shí)在體內(nèi)被磷酸化嗎？它們各有什么功能意義？

　　了解參與生物鐘蛋白質(zhì)，能否構(gòu)建很好的數(shù)學(xué)模型，在定性的基礎(chǔ)上邁進(jìn)定量的時代？

　　主鐘細(xì)胞內(nèi)的基因恐怕沒有窮盡，而是還有?！?/span>

　　主鐘的細(xì)胞間如何相互作用？只是神經(jīng)細(xì)胞參與生物鐘，還是有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與（Tso et al., 2017）？環(huán)路如何構(gòu)建？

　　中樞主鐘如何調(diào)節(jié)外周鐘？無論在果蠅還是哺乳類，都不能說十分清楚。果蠅這方面的一個研究論文被撤稿。而高橋?qū)嶒?yàn)室提出小鼠的主鐘通過調(diào)節(jié)體溫而協(xié)調(diào)外周鐘，也不一定是普遍為人們所接受?！?/span>

　　生物鐘與代謝、代謝疾病的關(guān)系及其機(jī)理（Turek et al., 2005；Lamia et al., 2008; Marcheva et al., 2010；Robles, Humphrey and Mann，2017）

　　本文討論的生物鐘，主要是近24小時的晝夜節(jié)律。還有非24小時的其他節(jié)律，它們的機(jī)理是什么？

　　基礎(chǔ)研究之外，生物鐘的研究應(yīng)該可以產(chǎn)出人類應(yīng)用的成果，但生物鐘研究迄今沒拿出調(diào)節(jié)時差的藥物?，F(xiàn)代社會對于調(diào)節(jié)時差有較大需求。各種值班導(dǎo)致英美近六分之一的上班族需要調(diào)時差，而且人類跨時區(qū)旅行量每年數(shù)以億計，老年人睡眠問題相當(dāng)部分是生物鐘異常所致，所以調(diào)節(jié)時差對于工作效率和生活質(zhì)量都很重要。大藥廠保守僵化，拘泥于已有領(lǐng)域（癌癥、神經(jīng)精神、抗感染…），對于時差不重視可能是原因之一。

　　理論上與生物鐘相關(guān)的問題中最重要的，是迄今理解不多的睡眠。理解生物鐘可以解釋睡眠的相位（何時睡），但不能解釋睡眠本身。睡眠的機(jī)理目前理解很少。教科書中睡眠的內(nèi)容相當(dāng)大部分是腦電圖的描繪，是現(xiàn)象的描述不是機(jī)理的理解。睡眠研究任重道遠(yuǎn)。Orexin及其受體的研究曾認(rèn)為是突破，但帶來的進(jìn)展有限。而2016年柳沢正史（Masashi Yanagisawa）及其合作者發(fā)現(xiàn)的Sik3基因，是否是睡眠分子機(jī)理的關(guān)鍵突破，值得拭目以待。（完）

　　作者注：本文起源于授課，文字始于2014年10月6日，繼續(xù)于2015和2016年10月，第一稿完成于2017年10月1日，10月2日部分修改。

　　注1：果蠅的四次諾貝爾獎為1933年美國的摩爾根（豐富染色體遺傳學(xué)說和規(guī)律），1947年摩爾根的學(xué)生穆勒（發(fā)現(xiàn)X線誘導(dǎo)基因突變），1995年美國的路易斯、德國的鈕斯蘭-沃哈特、美國的維西豪斯（發(fā)育的基因），2011年法國的霍夫曼（先天免疫的基因）。

　　注2：希望依靠論文引用數(shù)來衡量工作的效果不高。生物鐘領(lǐng)域最高引用的文章不過一千三百多次，而同領(lǐng)域其他較好的文章一般引用幾百次。這樣的數(shù)字比一些熱門領(lǐng)域少很多。其實(shí)是說明少數(shù)人推動了重要的研究領(lǐng)域，而人數(shù)眾引用多的領(lǐng)域是因跟風(fēng)者眾、并非做關(guān)鍵重要研究的人多?！?/span>

　　注3：年度的節(jié)律為cirannual，晝夜（接近24小時）為circadian，短于24小時的為ultradian，長于24小時的為infradian。

　　注4：John Watson的研究有爭議，從一例先天智力障礙的患者得出結(jié)論能否推廣，另外再倫理問題用小孩做干涉性實(shí)驗(yàn)如何消除對小孩的不良影響?！?/span>

　　注5：本文省略了對Konopka和Benzer用attached X的部分。摩爾根的妻子Lilian Morgan本來是獨(dú)立的科學(xué)家，結(jié)婚后暫停工作十幾年，生兒育女后重返實(shí)驗(yàn)室，只能在Morgan實(shí)驗(yàn)室，她五十多歲發(fā)現(xiàn)的attached X果蠅，對于果蠅研究很有用處。Konopka和Benzer用了attached X，省了一代的交配，加快了篩選速度。

　　注6：雖然只有動物有視覺，但動物和植物（以及有些細(xì)菌）都有感光系統(tǒng)，而動物和植物分別用一些分子感光，但只有Cry蛋白質(zhì)是動植物都用于感光的分子。這本來也是研究Cry是否參與晝夜節(jié)律的一個原因，但奇怪的是，后來的實(shí)驗(yàn)表明參與晝夜節(jié)律的Cry并不能感光，現(xiàn)在Cry的作用機(jī)理不明。

　　致謝：感謝李曉明、張二荃、徐瓔、俞強(qiáng)、劉欣、羅冬根、梁希同的修改或反饋。

　　（原標(biāo)題為《勇氣和運(yùn)氣：生物鐘的分子研究》）